Теоретичні відомості.

ОСНОВИ БІОТЕСТУВАННЯ

1 Загальні відомості про біотестування

Підвищення ефективності охорони вод від забруднення значною мірою пов`язане із застосуванням якісно нових підходів до оцінки складу й властивостей стічних вод, що відводять. До числа найбільш радикальних прийомів, що відповідають цілям водоохраны й ураховують її екологічний аспект, ставиться застосування інтегральних методів, що дозволяють проводити оцінку токсичності води. Таку оцінку можна одержати за допомогою биотестирования - експериментального визначення токсичності води - для гідробіонтів, заснованого на реєстрації реакцій тест-об`єктів. Биотестирование в контролі забруднення водного середовища може забезпечити рішення цілого ряду задач:

проведення токсикологічної оцінки промислових і міських стічних вод при сталому режимі скидання їх у водні об`єкти з метою виявлення потенційних джерел високого й экстремально високого забруднення вод;

контроль в оперативному й безперервному режимах аварійних й інших залпових скидань высокотоксичных стічних вод;

проведення оцінки ступеня токсичності стічних вод на різних стадіях формування для проектування локальних очисних споруджень;

контроль токсичності стічних вод, що подаються на біологічні очисні спорудження, з метою попередження надходження токсичних для біоценозу активного мулу забруднюючих речовин;

визначення рівнів безпечного розведення стічних вод для гідробіонтів по сумарній дії речовин, що скидають, з метою обліку результатів биотестирования при коректуванні й установленні гранично припустимих скидань (ГДС) речовин, що надходять у водні об`єкти зі стічними водами;

проведення токсикологічної оцінки сбросных і дренажних вод сільськогосподарського виробництва, що містять пестициди, при їхньому відведенні у водоприймачі;

здійснення оцінки стану природних вод і виявлення акваторій з импактным рівнем забруднення;

проведення екологічної експертизи нових технологій і матеріалів, проектів очисних споруджень, реконструкції й технічного переозброєння народногосподарських об`єктів.

Біотестування - процедура встановлення токсичності середовища за допомогою тест-об`єктів, що сигналізують про небезпеку незалежно від того, які речовини й у якому сполученні викликають зміни життєво важливих функцій у тест-об`єктів.

Біотестування як метод оцінки токсичності водного середовища використовується:

· при проведенні токсикологічної оцінки промислових, стічних побутових, сільськогосподарських, дренажних, забруднених природних й ін. вод з метою виявлення потенційних джерел забруднення,

· у контролі аварійних скидів високотоксичних стічних вод,

· при проведенні оцінки ступеня токсичності стічних вод на різних стадіях формування, при проектуванні локальних очисних споруд,

· у контролі токсичності стічних вод, що подаються на очисні споруди біологічного типу з метою попередження проникнення небезпечних речовин для біоценозів активного мулу,

· при визначенні рівня безпечного розведення стічних вод для гідробіонтів з метою обліку результатів біотестування при коректуванні й встановленні гранично допустимих скидів (ГДС) речовин, що надходять у водойми зі стічними водами,

· при проведенні екологічної експертизи нових матеріалів, технологій очищення, проектів очисних споруд й ін.

Тест-об`єкт - організм, використовуваний при оцінці токсичності хімічних речовин, природних і стічних вод, ґрунтів, донних відкладень, кормів й ін.

Тест-об`єкти – так звані "датчики" сигнальної інформації про токсичність середовища й замінники складних хімічних аналізів, що дозволяють оперативно констатувати факт токсичності (отруйності, шкідливості) водного середовища ("так" або "ні"), незалежно від того, чи обумовлена вона наявністю однієї точно визначеної аналітично речовини або цілого комплексу аналітично не визначених речовин, який звичайно являють собою стічні води.

Тест-об`єкти з відомим ступенем наближення дають кількісну оцінку рівня токсичності забруднення водного середовища - стічних, скидних, циркуляційних і природних вод.

Важлива умова правильного проведення біотестування - використання генетично однорідних лабораторних культур, тому що вони проходять перевірки чутливості, утримуються в спеціальних, обговорених стандартами лабораторних умовах, що забезпечують необхідну подібність і відтворюваність результатів досліджень, а також максимальну чутливість до токсичних речовин.

Життєва функція або критерій токсичності, використовують в біотестуванні для характеристики відгуку тест-об`єкта на дію, що ушкоджує, середовища.

Тест-фукнкції, що використовують як показники біотестування для різних об`єктів:

· для інфузорій, ракоподібних, ембріональних стадій молюсків, риб, комах - виживаність (смертність) тест-організмів.

· для ракоподібних, риб, молюсків - плідність, поява аномальних відхилень у ранньому ембріональному розвитку організму, ступінь синхронності дроблення яйцеклітин.

· для культур одноклітинних водоростей й інфузорій - загибель клітин, зміна (приріст або збиток) чисельності клітин у культурі, коефіцієнт ділення клітин, середня швидкість росту, добовий приріст культури.

· для рослин - енергія проростання насінь, довжина первинного кореня й ін.

Тривалість біотестування залежить від задачі, поставленої дослідником.

Гострі биіотести, виконувані на різних тест-об`єктах по показниках виживаності, тривають від декількох хвилин до 24-96 годин.

Короткострокові - хронічні тести тривають протягом 7 діб й закінчуються, як правило, після одержання першого покоління тест-об`єктів.
Хронічні тести на загальну плідність ракоподібних, що охоплюють 3 покоління, тривають до народження молоді в F3.

Інтегральна токсичність (integral toxicity), по визначенню Л. П. Брагинского, токсичність складних сумішей, стічних вод, багатокомпонентних факторів для водних організмів.

Кількісно інтегральна токсичність визначається як величина, зворотна максимальному розведенню (1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 і т.д.), при якому не спостерігається яких-небудь порушень життєво важливих функцій тест-організмів при 24-48 годинному біотестуванні.

Виражається в балах токсичності (БТ) цілими числами (2, 5, 10, 50, 100 і т.д.) відповідно величинам розведення.

Толерантність - витривалість (стійкість) організму доушкоджуючих впливів.

Діапазон толерантності - межі коливань концентрацій токсичних речовин, при яких не відбувається порушень функцій організму.

Толерантний ліміт - кількісне вираження концентрації токсиканта, при якій гине або виживає 50% тест-організмів за 48 ч досліду.

Токсикорезистентність - опірність живих організмів до впливу токсичних речовин.

Токсобність - здатність водних організмів існувати в токсичному середовищі, сорбуючи або використовуючи певну кількість токсичної речовини.

Токсикометрія - сукупність прийомів оцінки токсичності речовин. Основними прийомами токсикометрії є встановлення мінімально граничної концентрації (LC0), летальної концентрації (LС50), або дози (LD50), і зони токсичної дії - діапазону токсичних концентрацій - від LC0 до абсолютно летальної (LC100).

Біотестуваня, як правило, використовують до хімічного аналізу, тому що цей метод дозволяє провести експрес-оцінку природного середовища й виявити "гарячі точки", що вказують на найбільш забруднені ділянки акваторії (території, полігона). На ділянках, де методами біотестуваня виявлені які-небудь відхилення й досліджуване середовище характеризується як токсичне, аналітичним шляхом необхідно встановити причини цього явища.

Використання біотестування висуває ряд вимог, дотримання яких необхідне для отримання достовірних результатів. Серед останніх можна назвати наступні: відносна швидкість проведення досліджень, отримання достатньо точних і відтворюваних результатів, присутність об’єктів, застосовуваних у біотестуванні у великій кількості і з однорідними властивостями, а також діапазон погрішності у порівнянні з іншими методами тестування не більше 20%.

2 Класифікація методів біотестування

Існує велика кількість методів біотестування з використанням різних тест-об’єктів. Розглянувши методи біотестування, їх можна класифікувати за такими ознаками:

- за тест-об’єктом,

- за тест-системою,

- за тест-реакцією,

- за ступенем прояву тест-реакції,

- за тест-критерієм,

- за тривалістю біотестування,

- за засобом реалізації методу.

Тест-об’єкт – це чутливий біологічний елемент, здатний реагувати на зовнішній вплив. Тест-об’єктом можуть бути ферментативні системи, ізольовані органели, клітини, тканини, окремі органи багатоклітинних організмів, одноклітинні та багатоклітинні організми одного біологічного виду або кількох видів.

За тест-об’єктом методи біотестування можна поділити на:

- тести на організменному рівні (тест-організми: бактерії, мікроорганізми, водорості, безхребетні, молюски, риби, вищі рослини, які поділяються за систематичним найменуванням),

- тести на клітинному рівні (органели клітин),

- тести на генетичному рівні (мутагенність).

Тест-система – просторово обмежена сукупність чутливих біологічних елементів і середовища, в якому вони знаходяться. В залежності від тест-об’єкту, який знаходиться в тест-системі, останні можна поділити на ряд рівнів:

- молекулярний,

- субклітинний,

- клітинний,

- органотканинний,

- організмений,

- популяційно-видовий,

- мікро-, мезо-, макрокосм.

Тест-реакція – одна із закономірно виникаючих реакцій відгуку тест-системи або тест-організму на вплив комплексу зовнішніх факторів, що тестуються.

Тест-реакцією можуть бути такі зміни стану організму:

- генетичні,

- біохімічні,

- фізіологічні,

- анатомічні,

- морфологічні,

- поведінкові,

- біоритмічні.

За ступенем прояву тест-реакції біотесті поділяють на:

- тести на гостру токсичність (загибель організмів або зміна поведінки протягом 5 діб);

- тести на слабку токсичність ( у довгостроковому досліді у організмів знижуються основні біологічні функції, вони погано ростуть, гірше розмножуються, менш життєздатні);

- тести на нетоксичність (відсутність прояву токсичного ефекту навіть у ряді поколінь).

Характер токсичності може бути: токсичність (організм), цитотоксичність (клітина), генотоксичність (генетичні показники).

Тест-критерій – це показник по якому проводять оцінку змін стану тест-системи. В якості тест-критеріїв можуть використовуватись такі ознаки: виживаність, плодючість, аномальні відхилення у ранньому ембріональному розвитку, ступінь синхронності подрібнення яйцеклітин, рухливість, поведінкові реакції та періодичність їх повторюваності (для вищих організмів); загибель клітин, зміни чисельності клітин в культурі, коефіцієнт поділу клітин, середня швидкість росту, добовий приріст культури (для культур одноклітинних водоростей та інфузорій); енергія проростання насіння, схожість, довжина первинного кореня, зміна морфофізіологічних (або фізіолого-біологічних) показників (для вищих рослин).

За тривалістю біотестування тести поділяють на:

- експресні методи (визначення гострої токсичної дії),

- довгострокові методи (визначення хронічної токсичної дії).

За засобом реалізації методу:

- без застосування приладів (візуальні спостереження),

- за допомогою приладів (мікроскоп, люмінометр, флуоріметр, електрокардіограф або електроенцефалограф, фотоелектрокалориметр, спектрометр, спектрофотометр),

3 Основні методи біотестування

Таблиця 1 - Біотести, які застосовують в контролі об’єктів навколишнього середовища для оцінки рівня токсичного забруднення